气质联用法同时测定肉制品中的抗氧化剂和防腐剂

在食品中加入防腐剂可以延长保存期，防止腐烂变质，而食物中的油脂极易氧化发生酸败，并产生有毒物质，加入抗氧化剂可以预防这一过程的发生。山梨酸、苯甲酸、脱氢乙酸和对羟基苯甲酸酯类物质是国家批准可以在食品中*添加的防腐剂[1]，应用广泛，其对细菌、真菌、霉菌、酵母等有不同程度的抑制作用。丁基茴香醚（BHA）、2.6-二叔丁基对甲酚（BHT）、特丁基对苯二酚（TBHQ）3种人工合成的抗氧化剂常被使用以稳定油脂及含油脂较多的食品[2]。相比天然的抗氧化剂如VE、茶多酚等，价格低廉，应用较广泛，并且还有较强的抗菌作用，可以在预防油脂氧化的同时达到防腐的效果[3]。实验证明不同防腐剂以及不同抗氧化剂复合使用时，其效果优于单一使用时[3-5]。在实际工作中，根据产品质量监督抽查实施规范和发证检验的要求，通常需要同时检测食品中的几种防腐剂和抗氧化剂。按照GB/T5009—2003《食品卫生检验方法》，上述防腐剂和抗氧化剂要使用4种方法分别检测[6]，比较费时费力，已经有研究表明多种防腐剂能进行同时检测[7-8]，如果能发展一种方法，可以同时测定这几种常见的防腐剂和抗氧化剂，将大大的节约时间，节省费用。 
肉制品通常含有丰富的蛋白质和脂肪，营养丰富，适于有害微生物的生长，动物油脂也容易氧化。所以本实验选取肉制品中的熏煮香肠为原料，研究同时测定肉制品中抗氧化剂和防腐剂的方法。 
1 材料与方法 
1.1 材料与试剂 
熏煮香肠 镇江市美佳香食品有限公司。 
山梨酸、苯甲酸、脱氢乙酸、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸乙酯、对羟基苯甲酸丙酯、对羟基苯甲酸丁酯、丁基羟基茴香醚（BHA）、2，6-二叔丁基对甲酚（BHT）、特丁基对苯二酚（TBHQ）标准品 美国Sigma公司；乙mi（重蒸）、盐酸、无水硫酸钠 国药集团化学试剂有限公司；甲醇（色谱纯） 美国Tedia公司。 
1.2 仪器与设备 
7890A/5975C气质联用仪、7890A气相色谱仪带氢火焰离子化（FID）检测器 美国安捷伦公司；RE-52AA旋转蒸发器 上海亚荣生化仪器厂；AL204型电子天平 梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；TDZ5-WS台式低速自动平衡离心机 长沙湘智离心机仪器有限公司；料理机 九阳股份有限公司；声波清洗器 宁波新芝生物科技有限公司；HP-5MS毛细管色谱柱（30m×0.25mm，0.25μm）、HP-5毛细管色谱柱（30m×0.25mm×0.25μm） 美国J&W Scientific公司。1.3 方法 
1.3.1 标准曲线的配制 
分别称取上述10种标准品100mg，用甲醇定容至100mL，配制成质量浓度为1000mg/L的混合标准溶液，再用甲醇稀释，配制成质量浓度为0.5、1、2、4、20、50、100、250、500、1000mg/L的混合系列标准溶液。 
1.3.2 样品前处理 
称取2.5g绞碎均匀的试样，加入0.2mL 6mol/L盐酸酸化，再依次加入5mL水，10mL乙mi，声提取10min，4000r/min离心分层，将上层乙mi通过装有无水硫酸钠的漏斗滤入蒸馏瓶，再用10mL乙mi重复提取两次，合并滤液于250mL蒸馏瓶。将滤液于35℃条件下旋转浓缩至干，残渣用1mL甲醇定容，过0.22μm有机系滤膜，等待进样。 
1.3.3 仪器条件 
7890A/5975C气质联用仪，进样口230℃；色谱柱HP-5MS，初温60℃，以10℃/min升至250℃，保持5min；进样量1μL；载气为高纯氦气，流速1mL/min，分流比10：1；色谱-质谱接口温度280℃，离子源230℃，四级杆150℃；电离方式：EI，电离能量70eV；溶剂延迟5min。 
7890A气相色谱仪，进样口230℃；色谱柱HP-5，初温60℃，以10℃/min升至250℃，保持5min；进样量1μL；载气为高纯氮气，流速1mL/min，分流比10：1；FID检测器，温度300℃，空气流量300mL/min，氢气流量30mL/min。 
2 结果与分析 
2.1 方法线性范围与检出限 
用气质联用全扫描（SCAN）模式分析混标，各组分均能出峰，且分离良好（图1）。 
1.山梨酸；2.苯甲酸；3.脱氢乙酸；4.对羟基苯甲酸甲酯；5.BHA；6.BHT；7.对羟基苯甲酸乙酯；8.TBHQ；9.对羟基苯甲酸丙酯；10.对羟基苯甲酸丁酯。 
图1 10种物质混标的全扫描总离子图 
Fig.1 TIC of ten substances 
通过分析全扫描谱图，得到10种标准品的特征离子（如表1），可用于定性和定量。根据表1列出的特征离子，采用选择离子扫描（SIM）方式分析混合系列标准溶液。根据相同的保留时间（±0.5%）及定性离子丰度比定性，定量离子定量，以质量浓度为横坐标，响应值为纵坐标，得到10种物质的标准曲线、相关系数、线性范围及检出限见表2。 
表1 10种物质的定性和定性量选择离子 
Table 1 Qualitative and quantitative ions for ten substances 
标准品 保留时间/min 定性离子及丰度比 定量离子质荷比（m/z） 
山梨酸 5.32 97：112：67：55 （100：58：49：15） 97 
苯甲酸 6.71 105：122：77：51 （100：89：62：23） 105 
脱氢乙酸 9.60 168：153：85：125 （100：73：54：34） 168 
对羟基苯甲酸甲酯 10.65 121：152：93：65 （100：38：18：14） 121 
BHA 10.65 165：137：180：91 （100：61：52：10） 165 
BHT 11.09 205：220：57：145 （100：25：11：10） 205 
对羟基苯甲酸乙酯 11.45 121：138：166：93 （100：22：19：13） 121 
TBHQ 11.84 151：123：166：77 （100：85：52：10） 151 
对羟基苯甲酸丙酯 12.67 121：138：65：180 （100：59：12：7） 121 
对羟基苯甲酸丁酯 13.82 121：138：65：194 （100：87：13：6） 121 
从表2可以看出，10种物质在2～1000mg/L的质量浓度范围内都有良好的线性关系，相关系数都在0.999以上。其中3种抗氧化剂的线性范围宽，低可以达到0.5mg/L。在取样量为2.5g时，这10种物质的检出限在0.2～0.8mg/kg之间。 
表2 10种物质的回归方程 
Table 2 Standard curves of ten substances 
标准品 线性回归曲线 线性范围/ 相关系数 检出限 
（mg/L） /（mg/kg） 
山梨酸 Y=5.038×103X-1.063×105 2～1000 0.9998 0.8 
苯甲酸 Y=1.073×104X-2.910×105 2～1000 0.9991 0.8 
脱氢乙酸 Y=7.705×103X-2.185×105 2～1000 0.9994 0.8 
对羟基苯甲酸甲酯 Y=2.237×104X-3.008×105 1～1000 0.9999 0.4 
BHA Y=5.226×104X-3.827×104 0.5～1000 0.9999 0.2 
BHT Y=5.596×104X+8.492×105 0.5～1000 0.9990 0.2 
对羟基苯甲酸乙酯 Y=2.521×104X-3.293×105 1～1000 0.9996 0.4 
TBHQ Y=1.355×104X-3.718×104 0.5～1000 1 0.2 
对羟基苯甲酸丙酯 Y=2.359×104X-1.943×105 1～1000 1 0.4对羟基苯甲酸丁酯 Y=2.205×104X-2.635×105 1～1000 0.9999 0.4 
2.2 回收率实验 
选取不含上述10种物质的熏煮香肠作为试样，称取2.5g打碎均匀的试样6份，分别加入1000mg/L的混合标准溶液0.1、0.25、0.5、0.75、1mL，使试样中各物质的含量分别为40、100、200、300、400mg/kg，将试样混匀，放置过一夜，然后按1.3.2节方法处理，得到的回收率结果如表3。在不同的添加水平下，样品的加标回收率没有明显差异。3种抗氧化剂和7种防腐剂的回收率均在90%以上，且方法具有良好的重复性。 
表3 10种物质不同添加量的加标回收率 
Table 3 Spike recovery of ten substances in different concentrations 
成分 回收率% 平均回收率/ RSD 
40mg/kg 100mg/kg 200mg/kg 300mg/kg 400mg/kg % % 
山梨酸 94.3 95.6 94.2 97.8 96.7 95.7 1.62 
苯甲酸 93.3 94.4 96.6 97.0 97.7 95.8 1.95 
脱氢乙酸 93.8 94.9 96.9 97.2 97.9 96.1 1.79 
对羟基苯甲酸甲酯 91.9 92.2 92.0 93.5 95.6 93.0 1.69 
BHA 89.6 89.9 90.7 92.1 92.5 91.0 1.42 
BHT 90.4 90.7 91.3 93.0 94.1 91.9 1.73 
对羟基苯甲酸乙酯 91.1 91.6 92.7 93.4 94.7 92.7 1.55 
TBHQ 90.1 90.6 91.3 92.0 93.3 91.5 1.37 
对羟基苯甲酸丙酯 92.5 92.7 92.3 93.0 94.8 93.1 1.08 
对羟基苯甲酸丁酯 91.6 91.0 93.5 93.1 93.7 92.6 1.30 
2.3 气质联用方法和气相色谱-FID检测方法的比较 
目前的研究主要使用气相色谱法分析这几种物质[9]，本实验比较了气相色谱法和气质联用法的差别。把相同的标准系列溶液注入气相色谱仪，按1.3.3节所述方法进行检测。结果表明，在质量浓度为4mg/L时，上述10种物质在FID检测器的响应值比较低，接近检出限。在质量浓度为2mg/L时，各物质的响应值低于检出限。这说明，气质联用方法比气相色谱-FID检测法，能够获得更宽的线性范围和更低的检出限，对含量低时的检测更为有利。 
3 讨论 
本实验研究了采用气质联用，特征离子扫描法同时测定肉制品中3种抗氧化剂和7种防腐剂的方法。结果表明该方法色谱分离度好，线性范围宽。与国家标准5009系列分别采用GB/T5009.29—2003《食品中山梨酸、苯甲酸的测定》、GB/T5009.30—2003《食品中叔丁基羟基茴香醚（BHA）与2，6-二叔丁基对甲酚（BHT）的测定》、GB/T5009.31—2003《食品中对羟基苯甲酸酯类的测定》以及GB/T5009.121-2003《食品中脱氢乙酸的测定》气相色谱法测定这几种物质相比，本方法操作明显简单，检出限降低。近年来，有不少研究表明液相色谱法也可以同时测定几种防腐剂[10-11]，几种抗氧化剂的测定也有液相色谱方法[12-13]。杨春林等[14]研究了液相色谱同时测定抗氧化剂和对羟基酯类的方法。但由于这几种物质所需的流动相配比和检测波长不一致，使用液相色谱法同时测定还有困难。液相色谱-串联质谱法可以同时测定17种防腐剂和抗氧化剂[15]，但是液质联用仪价格昂贵，并不普遍。本实验所用的质谱检测器是一种通用型检测器，本方法为肉制品复配防腐剂和抗氧化剂的检测提供了依据。