您好,欢迎进入北京乐氏联创科技有限公司网站!
一键分享网站到:
产品列表

—— PROUCTS LIST

技术文章Article 当前位置:首页 > 技术文章 > 基于气质联用的款冬花蕾动态发育代谢组学特征分析

基于气质联用的款冬花蕾动态发育代谢组学特征分析

点击次数:1787 发布时间:2016-07-15

1 材料 
  款冬药材采自河北蔚县款冬种植基地,分别采集2009年9月3日,10月1日,11月5日,12月3日及2010年3月4日的款冬花,阴干备用。经山西大学中医药现代研究中心主任秦雪梅教授鉴定为菊科植物款冬T farfara,样品现保存于山西大学中医药现代研究中心。 
  甲醇(天津市登峰化学试剂厂,批号20110725272,纯度 995%),三氯甲烷(天津市风船化学试剂有限公司,批号20090223,纯度 990%),娃哈哈纯净水,二十四烷(AlfaAesar, 纯度>990%, 批号F14S034),MSTFA+1%TMCS (Pierce Chemical Company, USA,批号101043355),正庚烷(天津市光复精细化工研究所,批号NK20402000,纯度 995%),甲氧胺(上海晶纯试剂有限公司,批号11190,纯度 985%)。 
  Trace PolarisQ气相色谱质谱联用仪(配有电喷雾离子源及Xcalibur12数据处理系统美国Thermo Finnigan公司); LD5001电子天平 (沈阳龙腾电子有限公司);101系列恒温干燥箱 (北京和同创业科技有限责任公司);RE52A旋转蒸发器 (上海亚荣生化仪器厂)。 
  2 方法 
  21 样品制备 
  将款冬花样品液氮研磨至粉末,称取样品30 mg于10 mL玻璃离心管中,加入CH3ClMeOHH2O (2∶1∶1) 1 mL,超声提取30 min,3 000 r·min-1离心30 min,分为上层和下层。 
  211 上层(甲醇水层极性部分) 取上清液250 μL,旋转蒸干,残渣加30 μL盐酸甲氧胺吡啶溶液(20 g·L-1),70 ℃下反应1 h,冷却至常温后,加50 μL MSTFA+1%TMCS,37 ℃下反应30 min。后加入700 μL 正庚烷(含内标二十四烷01 g·L-1),转移至GC进样小瓶,涡旋1 min,045 μm微孔滤膜过滤,进行GCMS分析。 
  212 下层(氯仿层非极性部分) 将所有氯仿层移至25 mL圆底烧瓶中,旋转蒸干,加入600 μL的硫酸甲醇溶液(5%),50 ℃反应30 min,冷却至室温,加入200 μL水和200 μL正庚烷,振摇使分层,正庚烷层依次用200 μL碳酸氢钠水溶液(5%)和200 μL的氯化钠水溶液(5%)洗涤,正庚烷层加入无水硫酸钠干燥24 h,之后将其移出旋转蒸干,加入200 μL正庚烷(含内标二十四烷01 g·L-1),转移至GC进样小瓶,涡旋1 min,045 μm微孔滤膜过滤,进行GCMS分析。 
  22 色谱条件 
  221色谱柱 J&W DB5MS毛细管柱(025 mm×30 m,025 μm);进样口温度 280 ℃;载气(He)流速10 mL·min-1,不分流。 
  222 甲醇水层升温程序 50 ℃保持1 min,以每分钟10 ℃升至190 ℃,保持1 min;以每分钟3 ℃升至210 ℃,保持1 min,后以每分钟7 ℃升至280 ℃,保持5 min。溶剂延迟时间为4 min,进样量1 μL。 
  223 氯仿层升温程序 50 ℃保持2 min,以每分钟15 ℃升至160 ℃,保持1 min;以每分钟8 ℃升至210 ℃,保持1 min,后以每分钟5 ℃升至280 ℃,保持5 min。溶剂延迟时间为5 min,进样量2 μL。 
  23 质谱条件 
  电子轰击(EI)离子源;电子能量70 eV;传输线温度280 ℃;离子源温度200 ℃;质量扫描范围m/z 60~800。 
  24 数据分析 
  所有的GCMS原始数据通过GCMS仪器工作站软件Xcalibur由RAW格式转化为netCDF格式。GCMS图谱经XCMS软件预处理后(XCMS参数:fwhm75, snthresh2, max300, group bw10),导入Excel中对数据进行面归一化,之后将归一化的数据导入代谢组学软件SIMCAP 110 软件包(瑞典, Umetrics AB, Umea),对数据进行ctr标准化之后进行主成分分析(principal component analysis,PCA)和偏小二乘法判别分析(partial least squares discriminant analysis,PLSDA),通过载荷图(SPlot loading图)中的VIP(每个主成分变量对分开各组的贡献大小)来寻找生物标志物,后通过标准质谱数据库(NIST05)检索匹配结合对照品对部分代谢物进行指认,并通过计算各个标志物的内标归一化后的相对峰面积含量来进行定量分析,并且采用常规统计分析SPSS 115软件进行方差分析,结果用±s表示,显著性差异比较采用t检验。3 结果与分析 
  31 代谢物的指认 
  甲醇水层通过衍生化反应得到氨基酸,有机酸和糖类,其典型总离子流色谱图见图1;而氯仿层经过甲酯化得到的均为非极性小分子和脂肪酸类化合物,其典型总离子流色谱图见图2。氨基酸的指认是结合NIST05数据库,再通过与对照品的保留时间和离子碎片对照而确定的,见图3。目标峰在样品色谱图中的保留时间与标品的保留时间一致,而且离子碎片情况也基本一致,故确定其为天冬酰胺。其余色谱峰的结构指认方法同上,共指认出氨基酸11个,有机酸8个,糖类5个,脂肪酸10个和甾醇类化合物2个,此外还包括香橙烯及其他的一些长链烷烃类低极性化合物。 
  图5表明,散点图上可以看出极性部分各个组与采收期在X轴上均能明显分开,从Spslot载荷图(b)中可以得到每2组的差异代谢物。从图中可以得到,在发育初期的9月,其磷酸、甘油、苹果酸、柠檬酸、蔗糖和葡萄糖的含量较高,而发育中期的脯氨酸和赖氨酸的含量明显升高;3月款冬样品与采收期相比,开花后的脯氨酸、赖氨酸和蔗糖的含量降低,苹果酸、柠檬酸、果糖和葡萄糖的含量则呈升高的趋势。 
  2个不同采集月份与传统采收期的款冬花蕾样品相比得到的多元统计分析结果见图6,散点图上可以看出非极性部分发育初期和开花后与采收期10—12月份在X轴上均能明显分开,从图6中SPlot载荷图(b)中可以得到每2组的差异代谢物。与发育中期相比,在发育初期的9月,其棕榈酸、亚油酸、亚麻酸、硬脂酸的含量较高,香橙烯、花生四烯酸和谷甾醇的含量较低;在开花后的3月,其亚油酸的含量降低而花生四烯酸和谷甾醇的含量升高。 
  由以上标志代谢物的含量比较可以看出,差异主要体现在蔗糖、葡萄糖、脯氨酸、赖氨酸、苹果酸、柠檬酸、亚油酸、花生四烯酸和谷甾醇这9个共同的特征性差异代谢物含量上,故对其相对含量进行了t检验分析和比较,柱状图见图7。从图中可明显看到,脯氨酸和赖氨酸在花蕾发育初期含量较低,随着不断生长发育逐渐升高,开花后急剧下降;苹果酸和柠檬酸在发育初期较高,中期降低,开花后回升至接近初期水平;蔗糖的含量是呈逐渐下降趋势,在开花后降到低;葡萄糖在发育初期含量较高,随着生长其含量不断下降至低,而在开花后又回升至较高水平;谷甾醇的含量从发育初期到开花后是逐渐升高的。亚油酸在发育初期较低,逐渐升至高,开花后显著降低;而花生四烯酸则是呈相反的趋势,12月份降至低,而在开花后升至高。 
  4 讨论 
  崔贵梅等[8]曾对款冬花序芽的分化过程进行了观察,结果表明款冬从7月上旬至10月初经历花芽分化,因为花芽分化意味着植物从营养生长转向 生长,因此款冬花在越冬前后一定有营养积累和转化的过程。蔗糖是高等植物光合作用的主要产物,是多数植物体内运输碳水化合物的主要形式,为植物的生长发育提供物质和能量。款冬在未出土的发育初期9月到出土开花后的3月,蔗糖逐渐转化为其它营养和能量物质,其含量随着花蕾的发育逐渐降低。有机酸中的柠檬酸和苹果酸是三羧酸循环的重要中间产物,其含量在发育初期高,发育中期急剧降低,其含量降低的原因可能在于花蕾的发育中期需要大量的能量,有机酸转化为糖类为花蕾的发育提供能量。在花蕾发育中期,可能由于所需能量较多,葡萄糖也参与到能量供应中,通过糖酵解使其发生氧化而减少。氨基酸属于植物中的一大类初生代谢产物,生物体内氨基酸的主要作用是合成蛋白质或其他含氮化合物,在植物体内,特别是当种子萌发时,蛋白质发生强烈的降解作用,产生的氨基酸被重新利用形成幼苗中的蛋白质。故在本实验中,款冬花蕾样品中脯氨酸和赖氨酸初期含量较低,而后逐渐累积升至高,在开花后又急剧下降,可能是由于在花蕾的生长发育初期蛋白质分解转化为氨基酸,故氨基酸逐渐增多,中期含量升至高,开花后由于能量需求降低氨基酸则又合成为蛋白质,故其含量急剧降低。除此之外,脂肪酸也是一类重要的能量物质,亚油酸在花蕾发育过程中是呈先升高后降低的趋势,而花生四烯酸则是相反的趋势,其变化的机制尚不明确。 
  由于款冬花中次生代谢产物含量相对于初级代谢产物要低很多,而且NIST数据库中收载的仅为常见化合物的质谱数据,因此本实验中解析的化合物均为初级代谢产物,下一步将会采用传统的植化方法对款冬花中次生代谢产物进行系统分离,进而通过得到的次生代谢产物对照品进一步指认款冬花中的次生代谢产物。 
  本草记载中款冬花为花蕾未开花时根据经验方可采收,并未明确指出具体采收时期,目前尚没有科学的依据来做指导,导致市场上款冬花蕾质量参差不齐。本研究从化学的角度阐明10月、11月、12月的代谢组成相近,但合理的采收期还需要通过药效试验以及分析不同产地以及不同年份种植的样品进一步研究确定。 
  通常认为,中药的活性成分为次生代谢产物,其质量评价指标也多为次生代谢产物。如2010年版《中国药典》中规定,以款冬酮的含量评价款冬花的质量。然而,中药中还存在着大量的初级代谢产物,如氨基酸、糖类、有机酸和脂肪酸等。此外,按照中医传统,中药多以水煎入药,在煎出次生代谢产物的同时,大量初级代谢产物也被煎出。款冬中的初级代谢产物虽然没有直接的止咳化痰作用,但是近有研究[15]报道,一些氨基酸、有机酸和糖类可能作为天然低共溶溶剂(natural deep eutectic solvents,NADES)大量存在于生物细胞,被认为是细胞中的第3种液体,即天然离子液体。而植物细胞中包含的大量次级代谢产物属于中等极性的化合物,如芦丁、槲皮素等,其高浓度时既不溶于水也不溶于脂类(细胞膜),而该研究发现芦丁在NADES中的溶解度是水中的50~100倍。因此,可能作为细胞内天然离子液体的这些初级代谢产物,其含量与次生代谢产物的含量有着密切的关系。此外,这些初级代谢产物在中药内大量存在,其组成变化直接影响中药的均一性,因此,这些化合物的含量虽然与中药的有效性无直接关系,但对于中药的均一性控制非常重要。中药的作用特点为多成分多靶点协同作用,这些初生代谢产物对于药效发挥的协同作用值得进一步研究。

版权所有 © 2022 北京乐氏联创科技有限公司

总流量:539366  管理登陆  技术支持:化工仪器网  GoogleSitemap

ICP备案号:京ICP备06061264号-2
QQ在线客服
电话咨询
  • 13261220577
扫一扫访问手机站扫一扫访问手机站
访问手机站