固相微萃取技术在白蚁表皮碳氢化合物分析中的应用

白蚁是上*的检疫性有害生物，其中许多种类对农、林、水利、交通、化工、房屋建筑等方面危害巨大，涉及到国计民生的几乎各个方面。但在分类鉴定上由于白蚁的外部形态相似，体壁柔软，骨化程度低，可分类的性状较少。且白蚁的繁殖隔离机制主要不是通过 器官的结构来完成的，无论雌雄有翅繁殖成虫， 均为几块简单的骨片，分类鉴定时无法采用 的特征。因而目前对截获白蚁种类的鉴定主要根据兵蚁的形态，但兵蚁的形态有较大变异，更有一些类群缺乏兵蚁，利用兵蚁分类具有一定局限性，且不少白蚁的种类由于地域的差异形态有一定的趋同现象，这都给白蚁的分类带来了较大的困难。 
　　国内外研究报道，昆虫表皮碳氢化合物的组分和含量在种之间存在差异，即使在亲缘关系很近的种之间也有明显差异。由于昆虫表皮碳氢化合物组成具有一定的物种特异性和地理种群特异性，已在蜜蜂、蚂蚁、舌蝇、蟑螂、白蚁、棉铃虫的分类中得到了越来越多的应用。白蚁表皮碳氢化合物起着多种作用，影响到其取食、交配、蚁巢的构建以及其种群之间的防御。它是表皮蜡层中一类长链烃类，是蜡层的主要成分。是比较重要的信息物质，可以有效地抵制水分的散失和微生物的入侵。在白蚁表皮碳氢化合物的提取方法中，传统的正己烷提取法存在操作复杂、提取时间较难掌握等缺陷。 
　　本研究的目的为利用固相微萃取装置探索其在白蚁表皮碳氢化合物提取分析上的可行性，为白蚁鉴定工作鉴定提供一定的基础。 
　　 
　　1　材料与方法 
　　 
　　1.1供试虫源 
　　中国台湾乳白蚁Coptotermes formosanus Shiraki由无锡市白蚁防治所室内饲虫，试虫均为成熟健壮工蚁，试虫在(25±1)℃饥饿24 h后备用。 
　　 
　　1.2试剂与仪器 
　　手动SPME手柄，3种萃取头100 ttmPDMS萃取头、75 μmPDMS／DVB萃取头和85 gmPA苯取头(购置美国Supleeo公司)。 
　　Finnigan Trace GC Ultra型气相色谱仪(意大利Thermo Finnigan公司)，Finnigan Trace DSO型质谱仪(美国Thermo Electron公司)。色谱柱HP-5MS(30 m×250μm i.d，×0.25μm)(美国Agilent公司)。 
　　 
　　1.3仪器分析条件 
　　进样口温度为250℃，程序升温为80％保持1 min，16％／min升温到280％保持10 min。载气为He气，流速为0.5 mL／min，电子俘获检测器温度(ECD)温度为280℃，萃取头在进样口的停留时间为10 min，随后立即拔出，电子电离(EI)：70 ev。质谱扫描范围为m/x 40～650。 
　　 
　　1.4样品制备方法 
　　取50头白蚁兵蚁放于2 mL的萃取瓶中，在虫体上方加入金属网对白蚁进行隔离，同时插入萃取头进行萃取，萃取时间为30、60、90min以选出佳萃取时间。萃取完成后退去萃取头，随即进入气谱进样口中进行解析，每次解析时间为10 min。萃取头每使用1次后，都要在250℃的进样口中解吸附60 min。萃取头和萃取时间确定后，取同种白蚁进行萃取，重复4次。 
　　 
　　 
　　 
　　 
　　1.5数据分析 
　　所有数据利用Statistica 6.O分析差异显著性。 
　　 
　　2　结果与分析 
　　 
　　2.1萃取头的选择 
　　将3种萃取头用于萃取白蚁表皮碳氢化合物结果表明，85μmPA的萃取效率比100μmPDMS、75 tmaPDMS／dvb要低。PDMS与PDMS／dvb之间没有明显差异(图1)，但PDMS比PDMS／dvb萃取头的抗逆性能以及重复性要好。固而在以下实验中采取了用PDMS萃取的方法。 
　　 
　　2.2萃取温度对萃取效果的影响 
　　萃取时间对萃取效果的影响见图2，本实验选取了3个温度作为萃取的实验温度，分别为30、60和90℃，从图中可以看出随着温度的升高，萃取的峰面积越大，90℃时峰面积大，但与60℃时的峰面积之间没有差异性，但考虑到温度太高可能会导致白蚁体表物质变性，故而在本次实验中选取60℃为佳萃取温度。 
　　 
　　2.3萃取时间对萃取效果的影响 
　　由图3的温度实验结果表明，5个不同时间内均能萃取到碳氢化合物，但随着温度的升高萃取的物质的量逐渐增大(图3)。其中80min时的峰面积值高，其次为60 min，但两者之间差异不显著。60 min、80 min 2个萃取时间与其他3种萃取时间之间差异显著。故而在以下的实验中选取了60 min为适萃取时间。 
　　 
　　2.4 白蚁碳氢化合物组分及相对含量 
　　根据上述实验，得到白蚁的表皮碳氢化合物的总离子图(略)，采用峰面积归一化法求出各组分的相对含量，应用质谱对各组分进行定性分析，并与NIST谱库对照，鉴定出25种化合物。从表1的结果可以看出中国台湾乳白蚁表皮碳氢化合物主要为一些烷烃和烯烃类化合物，其链长从C₉～C₂₀共有24中化合物，其中已11，13一二甲基二十六烷烃的含量高，为33，34；其次为2，4，6，一*基二十七烷烃含量为15.75％。结果表明SPME可以用于白蚁的表皮碳氢化合物分析。 
　　 
　　3　讨论 
　　 
　　本研究中利用的固相微萃取(solid-phasemicroextraction，SPME)是20世纪90年代兴起并迅速发展的新型的样品前处理技术，无需有机溶剂，操作也很简便。该技术使用的是1支携带方便的萃取器，适于室内使用和野外的现场取样分析，也易于进行自动操作。这对样品数量多、操作周期短的常规分析极为重要，不仅省时省力，而且对提高方法的度和重现性有重要意义。 
　　传统的正己烷提取方法存在很多缺陷，如提取时间较难确定，时间较长会导致白蚁体内化学物质的溢出，严重影响GC—MS分析结果；时间较短会导致对白蚁表皮碳氢化合物成分提取不*，严重影响分析性，且操作方法较复杂。本研究中利用的SPME法能大大改善上述传统提取方法的缺陷。具有较强的使用价值，在昆虫信息物质提取分析方面具有广阔的应用前景。 
　　本实验结果表明，3种萃取头中100 μmPDMS萃取头对白蚁表皮碳氢化合物有好的萃取效果，且该种萃取头的重复性好抗逆性强，每次实验后应及时对萃取头进行高温解析，以清除其吸附的杂质，分析的。温度实验结果表明，所设定的3个温度中6022为佳萃取温度，温度过高或过底均会影响其物质的萃取。萃取时间试验表明，随着萃取时间的延长萃取物质的量逐渐增加，但到达一定时间后萃取的物质的量差异不显著。 
　　Harverty等多年来对白蚁的表皮碳氢化合物进行研究，通过对原白蚁属Zootermopsis群体(包括各个等级)的表皮碳氢物进行分析测定，发现了63个组分。根据各组分的有无、含量及统计分析结果，认为原白蚁属群体可分为4个*的碳氢物表现型，从而对Zootermopsis属现存3个种的划分提出质疑，认为如果表皮碳氢物具有种的特异性，那么Zooternwpsis应该至少有1个新种。 
　　本实验的碳氢化合物分析测定，发现了中国台湾乳白蚁24种碳氢化合物，这些化合物主要是由一组从C₉～C₂₉。的烷烃或烯烃内化合物组成，在白蚁表皮碳氢化合物中11,13-二甲基二十六烷烃的含量高，2，4，6，-*基二十七烷烃的含量次之。实验中白蚁表皮碳氢化合物分析，应尽量使用活虫，同时应避免萃取时对虫体进行过多的加热，破坏其表皮碳氢化合物组分。本实验为白蚁分类提供了一种科学的方法。