串联质谱法同时测定人体尿液中4种有机磷农药代谢物

1 引 言 
　　继有机氯农药被禁用后，有机磷类农药（Organophosphorus pesticides，OPs）成为国内目前农业生产上应用广泛、使用量大的农药[1]。OPs具有易降解、杀虫效果好、抗性不显著、残效期较短的特点，除广泛应用于农业生产中[2]，还常作为除草剂应用于公园、绿地等公共场所。 
　　OPs进入人体后代谢迅速，蓄积现象不明显。OPs由于其结构的相似性，进入体内后一般都能代谢成为6种二烷基磷酸酯（DialkylPhosphates，DAP）代谢产物中的1种或几种，在较短的时间内随尿排出[3]，主要有机磷农药代谢产物见表1。除6种二烷基磷酸酯外，OPs还会产生特殊代谢产物，每种特殊代谢产物通常只由特定的1种或几种OPs代谢产生，如毒死蜱、甲基毒死蜱的特殊代谢产物为3，5，6三氯2吡啶醇（3，5，6TCP），对硫磷、甲基对硫磷的特殊代谢产物为对硝基酚，马拉硫磷的特殊代谢产物为马拉硫磷二羟基酸[4]。 
　　近年来，农药暴露对人体健康的影响受到广泛关注[6～9]。根据OPs代谢较快的特点，检测人群尿液样品中OPs非特异性及特异性代谢物含量可有效评估人体的OPs暴露水平。检测尿液中OPs代谢物的方法主要有气相色谱质谱联用法[10～12]、气相色谱串联质谱法[13～15]、液相色谱串联质谱法[16～18]。液相色谱串联质谱法前处理较为简单，但实际应用中灵敏度不高，且基质效应造成的离子抑制比较普遍[19]。提取尿液中DAPs的方法主要有液/液萃取[10～12，15～17]、固相萃取[13，20]、冻干法[14]。本研究采用固相萃取液/液萃取气相色谱串联质谱技术建立了人体尿液中3种OPs非特异性代谢产物及1种特殊代谢产物的高灵敏检测方法，避免了液/液萃取使用yi醚对实验室造成的安全隐患，实验时间大幅缩短，净化效率优于冻干法。本方法为有机磷农药的人体内暴露研究提供了良好的技术支撑。 
　　2 实验部分 
　　2.1 仪器与试剂 
　　Quattra micro GCMS/MS（美国Waters公司）；AG285电子天平（瑞士Mettler公司）； MG2200氮吹仪（日本EYELA公司）；R210旋转蒸发器（瑞士Buchi公司）；WH3微型旋涡混合仪（上海楚定分析仪器有限公司，中国）；Centrifuge C5804离心机、恒温混匀仪（德国 Eppendorf公司）；MilliQ纯水器（美国Mimpore公司）。 
　　乙腈、乙酸乙酯、甲苯（分析纯，南京化学试剂有限公司）；甲醇、甲酸（色谱纯，德国Merck公司）；N叔丁基二甲基甲硅烷基N甲基三氟乙酰胺（MTBSTFA，>97.0%，美国Aldrich公司）。 其它试剂均为国产分析纯。 
　　Waters Oasis WCX固相萃取柱（150 mg，6 mL）、Waters Oasis HLB固相萃取柱（200 mg，6 mL）、Waters Oasis WAX固相萃取柱（60 mg，3 mL），均购自美国Waters公司。 
　　固相萃取DAPs：吸取尿液10.0 mL于100 mL具塞塑料离心管中，加入100 μL浓HCl，涡旋1 min，上样于Waters Oasis WCX固相萃取柱（柱子提前用6 mL甲醇、6 mL水活化），通过固相萃取小柱的尿液样品收集于100 mL塑料离心管中。上样后，干燥，用8 mL 10%甲酸甲醇溶液洗脱，洗脱液置于10 mL具塞比色管中。 
　　液/液萃取TCP：通过固相萃取小柱的尿液样品中加入适量NaOH，使样品pH≈7.0，加入2 g NaCl，涡旋至溶解，加入20 mL乙酸乙酯乙腈（70∶30， V/V），涡旋3 min，6000 r/min离心5 min。上清液经过含适量无水Na2SO4的漏斗转移至鸡心瓶中，旋蒸浓缩至2 mL左右。 
　　用移液器将萃取浓缩液移出至含洗脱液的比色管中，40℃水浴中氮吹至*干燥，比色管中加入0.5 mL甲苯，涡旋1 min，转移至1.5 mL玻璃小管中，加入10 μL 0.2 mg/L内标DBP，20 μL MTBSTFA，置于90℃恒温混匀仪中衍生化30 min。 
　　衍生化后的溶液冷却至室温，过0.22 μm有机相滤膜，供GCMS/MS分析。 
　　2.3 气相色谱条件 
　　DB5MS色谱柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）；程序升温：60℃保持2 min，以5℃/min升至90℃，以12℃/min升至160℃，再以10℃/min升至280℃，保持2 min；进样量1.0 μL；不分流进样，载气：氦气（99.999%），流量：1.0 mL/min，进样器温度： 250℃。 
　　2.4 质谱条件正离子模式的电喷雾电离ESI+，多反应离子监测（MRM），TCP采用选择离子检测（SIM）， EI源轰击能：70 eV，离子源温度：180℃，传输线温度：250℃，溶剂延迟时间：5.0 min，碰撞气：高纯氩气，保留时间定性，内标法定量。其它质谱参数见表2。 
　　3 结果与讨论 
　　3.1 基质的选择 
　　选择基质时，如采用人工合成尿液进行实验，虽然本底较为干净，干扰小，但人工尿液中不含蛋白质，与实际尿液有很大差距，不能有效反映人体实际尿液基质的复杂性。如采用单个个体尿液作为基质，有的个体存在较高的本底值，不适合测定方法的建立。因此，本实验通过筛选不同个体的尿液，选择本底干扰较小的人体尿液作为本实验的基质。 
　　3.2 前处理条件优化 
　　3.2.1 液/液萃取 文献报道DAPs和TCP提取均采用液/液萃取的方法，故本实验首先采用液/液萃取的方法提取DAPs和TCP。萃取溶剂见表3，结果见图2。结果表明，采取液/液萃取法提取DAPs时，同一提取方案对不同代谢物提取回收率差别较大，很难找到平衡方案使各代谢物的回收率均符合要求，TCP的液/液萃取回收率较高。由于TCP的pKa=7.5，近中性，故萃取时将溶液调至pH ≈7，确保萃取时TCP的存在形式为分子态[18]。 
　　3.2.2 固相萃取柱的选择 
　　目前文献所报道的DAPs和TCP提取多采用液/液萃取法，固相萃取法的报道较少。本实验分别考察了亲水亲油平衡柱（Waters Oasis HLB）、弱阳离子交换柱（Waters Oasis WCX）及弱阴离子交换柱（Waters Oasis WAX）对各代谢物的萃取效果，结果见图3。 
　　Waters Oasis HLB柱虽然适用范围较广，可从各种基质中分离出多种酸性、碱性和中性化合物，但DMTP回收率过高，其它物质则过低。Waters Oasis WAX柱为弱阴离子交换柱，适用于酸性物质， 具有高选择性，DAPs为酸性（DMP pKa=1.25， DMTP pKa=1.37， DEP pKa=1.37， DETP pKa=1.49），但本实验发现其对DMP、DEP基本没有保留，对DMTP、DETP虽有保留，但回收率非常不稳定，不适用于从尿液中提取DAPs，而TCP的pKa近中性，不易被WAX柱吸附。 
　　Waters Oasis WCX柱对DMTP、DEP、DETP、TCP均有保留，且回收率较稳定。Waters Oasis WCX柱为阳离子交换柱，可吸附带正电的分子。DAPs的pKa较低，呈酸性，实验中采用强酸酸化并不会使DAPs分子解离，而分子中的硫原子及氧原子含有孤对电子，吸引溶液中的氢质子，从而使DAPs分子质子化，带正电荷，可被WCX柱吸附。DMP相比于其它的DAPs，由于极性较大，正电性较弱，在WCX柱上基本无保留。WCX柱对除DMP外的DAPs及TCP均有保留，故选其作为固相萃取柱，并对其洗脱条件进行优化。 
　　3.2.3 洗脱条件的优化 在洗脱条件的优化中，分别考察10%甲酸甲醇溶液、20%甲酸甲醇溶液、30%甲酸甲醇溶液，10%甲酸乙腈溶液的洗脱效果，结果见图4。使用10%甲酸甲醇作为洗脱液时，各代谢物回收率在34.9%～77.5%之间（DMP基本无回收），高于20%甲酸甲醇溶液得到的回收率，且较30%甲酸甲醇溶液得到的回收率更为稳定。10%甲酸乙腈溶液的洗脱效果与10%甲酸甲醇溶甲醇溶液相当，TCP基本无回收。随着酸度增加，DAPs的回收率基本都是呈先降低再升高的趋势。使用10%甲酸甲醇作为洗脱液，回收率可以接受，且较为稳定。 
　　3.3 固相萃取与液/液萃取的比较 
　　采用表3中方案4作为液/液萃取方法，与优化过的固相萃取方法进行回收率的比较，结果见图5。 
　　对于DMTP， DEP和DETP，固相萃取的回收率和稳定性均高于液/液萃取。对于生物基质样品分析，方法的稳定性十分重要。液/液萃取提取TCP的回收率和稳定性优于固相萃取。用何种提取方法DMP，结果均不能令人满意。终采用固相萃取提取DMTP， DEP和DETP，采用表3中方案4提取TCP。 
　　3.4 衍生化反应 
　　本实验采用硅烷化试剂N（叔丁基二甲基硅烷基）N甲基三氟乙酰胺（MTBSTFA）对目标化合物进行衍生化反应。目标代谢物与衍生化试剂MTBSTFA的反应原理如图6所示，通过硅烷化作用将叔丁基二甲基硅烷基引入目标代谢物分子中，取代分子中的活性氢。 
　　文献[5，10，11，20，21]采用五氟溴苄苯（PFBBr）对DAPs进行衍生化，衍生化反应需加入适量K2CO3。与采用PFBBr相比，MTBSTFA的衍生化反应时间较短（PFBBr衍生化反应需16 h[21]），不需要其它试剂参与，不必考虑其它试剂的用量对衍生化效率的影响。 
　　3.5 方法学验证 
　　3.5.1 标准曲线及线性范围 向尿样中添加目标代谢物混合标准溶液，按2.2节中前处理方法进行提取、净化，在优化后的色谱及质谱条件下进样，绘制工作曲线，记录各待测物色谱峰面积（As）与内标色谱峰面积（Ar）。以各待测物与内标的峰面积比R （R= As/As）对浓度（C，mg/L）进行线性回归，确定线性范围及检出限、定量限。检出限和定量限分别以3和10倍信噪比的浓度来确定。DMP在固相萃取柱上基本无保留，其它代谢物制定工作曲线得到的线性方程相关系数均在0.9923～0.9942之间，表明各代谢物在相应的浓度范围内线性关系良好， 结果见表4。 
　　3.5.2 方法的回收率及精密度 由于无法获得所分析的代谢物引入叔丁基二甲基硅烷基的标准品，衍生化反应效率无法确定，整个样品制备过程的回收率无法考察。本研究按2.2节方法同时处理加标与未加标的基质，未加标基质在衍生化前加入等量标准溶液，由两者响应的比值计算回收率，设置低、中、高3个添加浓度，结果见表5。生物体液样本基质较为复杂，分析前需要经过衍生化反应，处理步骤较多，回收率低于基质单一的样品。3.5.3 基质效应 采用提取后添加法评定基质效应。按照2.2节方法处理尿液基质，衍生化前加入标准品溶液，进样后所得峰面积记为A组峰面积；纯溶剂衍生化前加入标准品溶液，进样后所得峰面积记为B组峰面积。以A组峰面积与B组峰面积的比值（A/B）考察基质效应，4种代谢物的基质效应在60%～176%之间，故采用基质加标工作曲线消除基质效应的影响。 
　　3.6 气相色谱质谱条件优化 
　　根据目前已有文献报道，本研究尝试了不同的升温程序。优化后的色谱图见图7，各物质峰形良好，分离效果。 
　　代谢物衍生化后在EI源中主要的裂解方式见图7，运用Daughter Scan模式，进行子离子扫描，并对碰撞能量进行优化，以达到较高的灵敏度。3，5，6TCP在正离子检测方式下，基峰为m/z 256，运用Daughter Scan模式，进行子离子扫描， 结果并未发现响应稳定且较强的碎片峰，这与3，5，6TCP的环状结构特点较为一致。 
　　3.7 样品分析 
　　采集居住在农药厂附近居民的晨尿样品40份，其中儿童尿液样品20份，成人尿液样品20份，按2.2节中的实验方法进行处理，测定结果见表6。 
　　结果表明，成人尿液样品DMTP， DEP， DETP， TCP检出率分别为85%， 90%， 90%， 45%，儿童尿液样品分别为35%， 75%， 65%， 60%。成人尿液中非特异性代谢物DMTP， DEP， DETP的检出率均高于儿童，特异性代谢物TCP的检出率低于儿童。结果表明，居住在农药厂附近的成人与儿童均有不同程度的有机磷农药内暴露，呼吸可能是造成有机磷农药内暴露的重要途径。以尿液中代谢物作为评估有机磷农药暴露程度的指标，成人的暴露量大于儿童，这是由于成人的呼吸量较大， 且对农药的代谢能力较强。不同成人与儿童尿液中有机磷代谢物检出的差异与其住所位置、膳食结构等都有密切的关系。 
　　4 结 论 
　　建立了固相萃取气相色谱串联质谱同时分析制尿液中4种OPs代谢物的方法，定量检测了人体尿液中4种代谢物含量。本研究采用WCX固相萃取柱，与液/液萃取相比，耗费的有机溶剂更少，耗时更短，适合于大批量样品的前处理，为研究人群中低剂量OPs农药暴露情况提供了方法学基础。