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串联质谱法同时测定人体尿液中4种有机磷农药代谢物

点击次数:1382 发布时间:2016-07-12

1 引 言 
  继有机氯农药被全面禁用后,有机磷类农药(Organophosphorus pesticides,OPs)成为国内目前农业生产上应用广泛、使用量大的农药[1]。OPs具有易降解、杀虫效果好、抗性不显著、残效期较短的特点,除广泛应用于农业生产中[2],还常作为除草剂应用于公园、绿地等公共场所。 
  OPs进入人体后代谢迅速,蓄积现象不明显。OPs由于其结构的相似性,进入体内后一般都能代谢成为6种二烷基磷酸酯(DialkylPhosphates,DAP)代谢产物中的1种或几种,在较短的时间内随尿排出[3],主要有机磷农药代谢产物见表1。除6种二烷基磷酸酯外,OPs还会产生特殊代谢产物,每种特殊代谢产物通常只由特定的1种或几种OPs代谢产生,如毒死蜱、甲基毒死蜱的特殊代谢产物为3,5,6三氯2吡啶醇(3,5,6TCP),对硫磷、甲基对硫磷的特殊代谢产物为对硝基酚,马拉硫磷的特殊代谢产物为马拉硫磷二羟基酸[4]。 
  近年来,农药暴露对人体健康的影响受到广泛关注[6~9]。根据OPs代谢较快的特点,检测人群尿液样品中OPs非特异性及特异性代谢物含量可有效评估人体的OPs暴露水平。检测尿液中OPs代谢物的方法主要有气相色谱质谱联用法[10~12]、气相色谱串联质谱法[13~15]、液相色谱串联质谱法[16~18]。液相色谱串联质谱法前处理较为简单,但实际应用中灵敏度不高,且基质效应造成的离子抑制比较普遍[19]。提取尿液中DAPs的方法主要有液/液萃取[10~12,15~17]、固相萃取[13,20]、冻干法[14]。本研究采用固相萃取液/液萃取气相色谱串联质谱技术建立了人体尿液中3种OPs非特异性代谢产物及1种特殊代谢产物的高灵敏检测方法,避免了液/液萃取使用yi醚对实验室造成的安全隐患,实验时间大幅缩短,净化效率优于冻干法。本方法为有机磷农药的人体内暴露研究提供了良好的技术支撑。 
  2 实验部分 
  2.1 仪器与试剂 
  Quattra micro GCMS/MS(美国Waters公司);AG285电子天平(瑞士Mettler公司); MG2200氮吹仪(日本EYELA公司);R210旋转蒸发器(瑞士Buchi公司);WH3微型旋涡混合仪(上海楚定分析仪器有限公司,中国);Centrifuge C5804离心机、恒温混匀仪(德国 Eppendorf公司);MilliQ超纯水器(美国Mimpore公司)。 
  乙腈、乙酸乙酯、甲苯(分析纯,南京化学试剂有限公司);甲醇、甲酸(色谱纯,德国Merck公司);N叔丁基二甲基甲硅烷基N甲基三氟乙酰胺(MTBSTFA,>97.0%,美国Aldrich公司)。 其它试剂均为国产分析纯。 
  Waters Oasis WCX固相萃取柱(150 mg,6 mL)、Waters Oasis HLB固相萃取柱(200 mg,6 mL)、Waters Oasis WAX固相萃取柱(60 mg,3 mL),均购自美国Waters公司。 
  固相萃取DAPs:准确吸取尿液10.0 mL于100 mL具塞塑料离心管中,加入100 μL浓HCl,涡旋1 min,上样于Waters Oasis WCX固相萃取柱(柱子提前用6 mL甲醇、6 mL水活化),通过固相萃取小柱的尿液样品收集于100 mL塑料离心管中。上样后,干燥,用8 mL 10%甲酸甲醇溶液洗脱,洗脱液置于10 mL具塞比色管中。 
  液/液萃取TCP:通过固相萃取小柱的尿液样品中加入适量NaOH,使样品pH≈7.0,加入2 g NaCl,涡旋至溶解,加入20 mL乙酸乙酯乙腈(70∶30, V/V),涡旋3 min,6000 r/min离心5 min。上清液经过含适量无水Na2SO4的漏斗转移至鸡心瓶中,旋蒸浓缩至2 mL左右。 
  用移液器将萃取浓缩液移出至含洗脱液的比色管中,40℃水浴中氮吹至完全干燥,比色管中加入0.5 mL甲苯,涡旋1 min,转移至1.5 mL玻璃小管中,加入10 μL 0.2 mg/L内标DBP,20 μL MTBSTFA,置于90℃恒温混匀仪中衍生化30 min。 
  衍生化后的溶液冷却至室温,过0.22 μm有机相滤膜,供GCMS/MS分析。 
  2.3 气相色谱条件 
  DB5MS色谱柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm);程序升温:60℃保持2 min,以5℃/min升至90℃,以12℃/min升至160℃,再以10℃/min升至280℃,保持2 min;进样量1.0 μL;不分流进样,载气:氦气(99.999%),流量:1.0 mL/min,进样器温度: 250℃。 
  2.4 质谱条件正离子模式的电喷雾电离ESI+,多反应离子监测(MRM),TCP采用选择离子检测(SIM), EI源轰击能:70 eV,离子源温度:180℃,传输线温度:250℃,溶剂延迟时间:5.0 min,碰撞气:高纯氩气,保留时间定性,内标法定量。其它质谱参数见表2。 
  3 结果与讨论 
  3.1 空白基质的选择 
  选择空白基质时,如采用人工合成尿液进行实验,虽然本底较为干净,干扰小,但人工尿液中不含蛋白质,与实际尿液有很大差距,不能有效反映人体实际尿液基质的复杂性。如采用单个个体尿液作为空白基质,有的个体存在较高的本底值,不适合测定方法的建立。因此,本实验通过筛选不同个体的尿液,选择本底干扰较小的人体尿液作为本实验的空白基质。 
  3.2 前处理条件优化 
  3.2.1 液/液萃取 大量文献报道DAPs和TCP提取均采用液/液萃取的方法,故本实验首先采用液/液萃取的方法提取DAPs和TCP。萃取溶剂见表3,结果见图2。结果表明,采取液/液萃取法提取DAPs时,同一提取方案对不同代谢物提取回收率差别较大,很难找到平衡方案使各代谢物的回收率均符合要求,TCP的液/液萃取回收率较高。由于TCP的pKa=7.5,近中性,故萃取时将溶液调至pH ≈7,确保萃取时TCP的存在形式为分子态[18]。 
  3.2.2 固相萃取柱的选择 
  目前文献所报道的DAPs和TCP提取多采用液/液萃取法,固相萃取法的报道较少。本实验分别考察了亲水亲油平衡柱(Waters Oasis HLB)、弱阳离子交换柱(Waters Oasis WCX)及弱阴离子交换柱(Waters Oasis WAX)对各代谢物的萃取效果,结果见图3。 
  Waters Oasis HLB柱虽然适用范围较广,可从各种基质中分离出多种酸性、碱性和中性化合物,但DMTP回收率过高,其它物质则过低。Waters Oasis WAX柱为弱阴离子交换柱,适用于酸性物质, 具有高选择性,DAPs为酸性(DMP pKa=1.25, DMTP pKa=1.37, DEP pKa=1.37, DETP pKa=1.49),但本实验发现其对DMP、DEP基本没有保留,对DMTP、DETP虽有保留,但回收率非常不稳定,不适用于从尿液中提取DAPs,而TCP的pKa近中性,不易被WAX柱吸附。 
  Waters Oasis WCX柱对DMTP、DEP、DETP、TCP均有保留,且回收率较稳定。Waters Oasis WCX柱为阳离子交换柱,可吸附带正电的分子。DAPs的pKa较低,呈酸性,实验中采用强酸酸化并不会使DAPs分子解离,而分子中的硫原子及氧原子含有孤对电子,吸引溶液中的氢质子,从而使DAPs分子质子化,带正电荷,可被WCX柱吸附。DMP相比于其它的DAPs,由于极性较大,正电性较弱,在WCX柱上基本无保留。WCX柱对除DMP外的DAPs及TCP均有保留,故选其作为固相萃取柱,并对其洗脱条件进行优化。 
  3.2.3 洗脱条件的优化 在洗脱条件的优化中,分别考察10%甲酸甲醇溶液、20%甲酸甲醇溶液、30%甲酸甲醇溶液,10%甲酸乙腈溶液的洗脱效果,结果见图4。使用10%甲酸甲醇作为洗脱液时,各代谢物回收率在34.9%~77.5%之间(DMP基本无回收),高于20%甲酸甲醇溶液得到的回收率,且较30%甲酸甲醇溶液得到的回收率更为稳定。10%甲酸乙腈溶液的洗脱效果与10%甲酸甲醇溶甲醇溶液相当,TCP基本无回收。随着酸度增加,DAPs的回收率基本都是呈先降低再升高的趋势。使用10%甲酸甲醇作为洗脱液,回收率可以接受,且较为稳定。 
  3.3 固相萃取与液/液萃取的比较 
  采用表3中方案4作为液/液萃取方法,与优化过的固相萃取方法进行回收率的比较,结果见图5。 
  对于DMTP, DEP和DETP,固相萃取的回收率和稳定性均高于液/液萃取。对于生物基质样品分析,方法的稳定性十分重要。液/液萃取提取TCP的回收率和稳定性优于固相萃取。用何种提取方法DMP,结果均不能令人满意。终采用固相萃取提取DMTP, DEP和DETP,采用表3中方案4提取TCP。 
  3.4 衍生化反应 
  本实验采用硅烷化试剂N(叔丁基二甲基硅烷基)N甲基三氟乙酰胺(MTBSTFA)对目标化合物进行衍生化反应。目标代谢物与衍生化试剂MTBSTFA的反应原理如图6所示,通过硅烷化作用将叔丁基二甲基硅烷基引入目标代谢物分子中,取代分子中的活性氢。 
  文献[5,10,11,20,21]采用五氟溴苄苯(PFBBr)对DAPs进行衍生化,衍生化反应需加入适量K2CO3。与采用PFBBr相比,MTBSTFA的衍生化反应时间较短(PFBBr衍生化反应需16 h[21]),不需要其它试剂参与,不必考虑其它试剂的用量对衍生化效率的影响。 
  3.5 方法学验证 
  3.5.1 标准曲线及线性范围 向空白尿样中添加目标代谢物混合标准溶液,按2.2节中前处理方法进行提取、净化,在优化后的色谱及质谱条件下进样,绘制工作曲线,记录各待测物色谱峰面积(As)与内标色谱峰面积(Ar)。以各待测物与内标的峰面积比R (R= As/As)对浓度(C,mg/L)进行线性回归,确定线性范围及检出限、定量限。检出限和定量限分别以3和10倍信噪比的浓度来确定。DMP在固相萃取柱上基本无保留,其它代谢物制定工作曲线得到的线性方程相关系数均在0.9923~0.9942之间,表明各代谢物在相应的浓度范围内线性关系良好, 结果见表4。 
  3.5.2 方法的回收率及精密度 由于无法获得所分析的代谢物引入叔丁基二甲基硅烷基的标准品,衍生化反应效率无法确定,整个样品制备过程的回收率无法考察。本研究按2.2节方法同时处理加标与未加标的空白基质,未加标空白基质在衍生化前加入等量标准溶液,由两者响应的比值计算回收率,设置低、中、高3个添加浓度,结果见表5。生物体液样本基质较为复杂,分析前需要经过衍生化反应,处理步骤较多,回收率低于基质单一的样品。3.5.3 基质效应 采用提取后添加法评定基质效应。按照2.2节方法处理空白尿液基质,衍生化前加入标准品溶液,进样后所得峰面积记为A组峰面积;纯溶剂衍生化前加入标准品溶液,进样后所得峰面积记为B组峰面积。以A组峰面积与B组峰面积的比值(A/B)考察基质效应,4种代谢物的基质效应在60%~176%之间,故采用基质加标工作曲线消除基质效应的影响。 
  3.6 气相色谱质谱条件优化 
  根据目前已有文献报道,本研究尝试了不同的升温程序。优化后的色谱图见图7,各物质峰形良好,分离效果理想。 
  代谢物衍生化后在EI源中主要的裂解方式见图7,运用Daughter Scan模式,进行子离子扫描,并对碰撞能量进行优化,以达到较高的灵敏度。3,5,6TCP在正离子检测方式下,基峰为m/z 256,运用Daughter Scan模式,进行子离子扫描, 结果并未发现响应稳定且较强的碎片峰,这与3,5,6TCP的环状结构特点较为一致。 
  3.7 样品分析 
  采集居住在农药厂附近居民的晨尿样品40份,其中儿童尿液样品20份,成人尿液样品20份,按2.2节中的实验方法进行处理,测定结果见表6。 
  结果表明,成人尿液样品DMTP, DEP, DETP, TCP检出率分别为85%, 90%, 90%, 45%,儿童尿液样品分别为35%, 75%, 65%, 60%。成人尿液中非特异性代谢物DMTP, DEP, DETP的检出率均高于儿童,特异性代谢物TCP的检出率低于儿童。结果表明,居住在农药厂附近的成人与儿童均有不同程度的有机磷农药内暴露,呼吸可能是造成有机磷农药内暴露的重要途径。以尿液中代谢物作为评估有机磷农药暴露程度的指标,成人的暴露量大于儿童,这是由于成人的呼吸量较大, 且对农药的代谢能力较强。不同成人与儿童尿液中有机磷代谢物检出的差异与其住所位置、膳食结构等都有密切的关系。 
  4 结 论 
  建立了固相萃取气相色谱串联质谱同时分析制尿液中4种OPs代谢物的方法,定量检测了人体尿液中4种代谢物含量。本研究采用WCX固相萃取柱,与液/液萃取相比,耗费的有机溶剂更少,耗时更短,适合于大批量样品的前处理,为研究人群中低剂量OPs农药暴露情况提供了方法学基础。 

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