发酵桂叶渣挥发性芳香气体成分固相微萃取气相色谱

肉桂（Cinnamomum cassia presl）又名玉桂，系樟科樟属，常绿乔木，是一种珍贵的药材，也是我国特产的香辛料食及日用化工产品的香料药材[1-2]。目前市场上肉桂皮主要作为香料食材、药材使用，肉桂叶主要用于肉桂油的提取。肉桂油的提取一般利用水蒸气蒸馏、临界萃取等技术从肉桂皮、肉桂枝叶中提取肉桂油，肉桂油已被广泛应用于各类食品及日化行业中。提取精油后的桂皮渣及桂叶渣基本当作燃料或直接遗弃，目前对桂皮渣的利用和研究有少量相关报道，如张笮晦等[3]对桂皮渣进行生物降解制备肉桂酰胺，库咏峰[4]对桂皮渣中的黄酮类物质进行相关研究，但未见有以桂叶渣为原料进行生物发酵的相关研究。 
　　本文通过固相微萃取气质联用技术研究桂叶渣发酵后挥发性香气成分，通过指纹图谱和文献资料对比确定香气中每个化学成分，通过香气成分的变化来研究发酵过程中桂叶渣化学成分的变化。直接分析发酵后发酵产物化学成份非常困难和复杂，通过本方法可快速简便的判断发酵产物中部分化学成分的变化和发酵的深度，为进一步开发利用桂叶渣提供理论基础。 
　　1 材料与方法 
　　1.1 材料 
　　1.1.1 实验材料 
　　发酵原料桂叶渣：肉桂叶经水蒸气蒸馏提取桂油后所得残渣，本实验所用桂叶渣取至广西防城港市那梭香料厂；微生物菌种：EM菌（北京康源绿洲生物科技有限公司），酵母菌（市场购买）。 
　　1.1.2 主要仪器 
　　电热恒温干燥箱（天津泰斯特仪器有限公司 WGLL-230BE），数显电热培养箱（上海仪纯实业有限公司DH250A），TQ456气质联用仪（美国BRUKER公司），色谱柱[弹性石英毛细管柱BR-5（30 m×0.25 mm×0.25 μm）] ，SPME手动进样器（50/30 μm），微萃取探头[DVB/CAR/PDMS萃取纤维（北京康林科技有限公司）]。 
　　1.2 方法 
　　1.2.1 桂叶渣发酵 
　　1.2.1.1 菌种活化及制备 
　　酵母菌：以菌水质量比1∶80混合均匀，水域控温35℃，搅拌15 min后，备用；EM菌：将质量百分比15%红糖水和EM菌按l∶50质量之比混合，搅拌均匀，密封发酵，30℃恒温培养箱中培养 3 d，测得pH 4左右，备用；混合菌剂：将活化好的酵母菌与EM菌按1∶1混合后作为本次试验所用发酵菌剂。1.2.1.2 发酵原料处理 
　　原料经粉碎机粉碎，过16目筛（d=1 mm），放置于烘箱120℃灭菌15 min. 
　　1.2.1.3 发酵条件 
　　原料与混合菌液质量比10∶1、料水比1∶1，温度30℃接种后密封发酵10 d。 
　　1.2.2 顶空固相微萃取（HS-SPME）[5-7] 
　　称取发酵桂叶渣样品3.0 g置于15 mL带有聚四氟乙烯隔垫的样品瓶内，加盖封口密封，把样品瓶移到恒温加热部件上预热到90℃，通过隔垫插入已活化好的DVB/CAR/PDMS涂层SPME萃取头（270℃活化30 min），并推出纤维头，顶空吸附10 min，纤维头进入GC-MS的进样口在230℃解析120 s。 
　　1.2.3 GC-MS分析 
　　定性分析：样品用气相色谱质谱计算机联用仪分析鉴定，通过 NIST02 谱图库自动检索获得初步鉴定结果，根据所得质谱图，与EPA/NIH 质朴图集的标注谱图对照，结合相关文献作人工谱图解析，终确定挥发油中各化学成份的相对质量分数；定量分析：通过 Xcalibur 化学工作站数据处理系统，按照峰面积归一法进行定量分析，求出挥发油中各化学成分的相对质量分数；色谱条件：载气为高纯氦气；程序升温：40℃（1 min），以3℃/min升至100℃，以10℃/min升至200℃，再以5℃/min升至230℃，停留3 min；进样口230℃；接口250℃。分流比1∶1；质谱条件：EI离子源；电离电压70 ev；扫描范围45～350 amu；全扫描方式。 
　　2 结果与分析 
　　2.1 发酵后肉桂渣 
　　颜色：成黄褐色、无霉烂、无黑色结块。气味：带有酸香、醇香味，无腐臭味、无强酸味、无霉味。质地：蓬松、柔软，无手感发粘及结块现象。 
　　2.2 顶空固相微萃取气质联用香气组分分析 
　　2.2.1 发酵肉桂叶渣SPME-GC-MS总离子流图 
　　从表1可知，见图1。 
　　2.2.2 香气挥发成分组成 
　　SPME-GC-MS分离鉴定出的发酵桂叶渣挥发性芳香气体成分及其相对质量分数见表1。 
　　其主要成分为酯类，有28个化合物，占总峰面积37.77%，其次为烯烃类，有24个化合物，占总峰面积的35.54%，醇类有6个化合物占5.58%，酸类有3个化合物占1.08%，其他成分占2.29%（图2）。 
　　主要挥发性芳香气体成分为乙酸乙酯8.375%、己酸丁酯6.337%、丁酸丁酯4.866%、δ荜澄茄烯4.612%、 r-衣兰油烯4.405%、α-衣兰油烯3.416%、古巴烯3.313%等。 
　　3 讨论与结论 
　　本研究中发酵桂叶渣固相微萃取成分中几乎未发现有反式-肉桂醛、苯甲醛、顺式-肉桂醛、苯乙烯、香豆素、乙酸肉桂酯、水杨醛等桂叶挥发性成分[8]。说明本研究所用桂叶经过水蒸气蒸馏提取肉桂油工艺后，肉桂叶中的挥发成份几乎没有残留。肉桂叶经过水蒸气蒸馏后所剩桂叶渣几乎没有芳香气味，而经过发酵工艺后发酵桂叶渣气味芳香。 
　　本研究利用固相微萃取气质联用技术分析出的芳香味主要成分为：乙酸乙酯8.375%、己酸丁酯6.337%、丁酸丁酯4.866%、δ-荜澄茄烯4.612%、 r-衣兰油烯4.405%、α-衣兰油烯3.416%、古巴烯3.313%等酯类、烯烃类、醇类、酸类。 
　　研究说明，发酵后化学成份发生了较大的变化，挥发性芳香气味的成份是肉桂叶及桂叶渣中未检测出的物质，一方面，说明本研究所配制的发酵菌酶及发酵工艺对桂叶渣也能产生了非常有效的作用，通过菌酶的作用降解了桂叶渣中的粗纤维，同时生成了酯、烯、酸、醇、醛等各种有机化合物，从而使原本无味的桂叶渣具备了芳香气味。另一方面，如果将发酵桂叶渣作为发酵饲料进行开发利用，通过生物发酵[9-10]能大大的改善原料的适口性，是一种有效的方法，也有广阔的发展空间。 
　　研究发现，菌种和发酵工艺的选择对桂叶渣发酵的效果有很大的影响，有待进一步进行深入研究；另外在检测到的成分中出现峰面积较大的涂，因微萃取纤维头吸附挥发性成分的量非常微小，以至于检测到从色谱柱和纤维头涂层中携带出的一些微量化学成份所形成的峰的面积相对较大，对检测结果造成了不小的影响，在研究中应注意规避和排除其对结果的影响。本研究将为进一步开发利用桂叶渣，为更好的利用肉桂特色资源提供理论基础。