固相萃取—液相色谱法测定养殖水体中磺胺类抗生素

养殖水体是水生生物的集聚场所，具有生物密度高、组成多样、水色深、颗粒悬浊物多、抗生素药物组成复杂等特点。水中抗生素的存在会直接引发水产品药物残留量标事件，给人们的健康带来极大的隐患，同时也严重影响我国水产品进出口贸易的发展[1]。目前，对水体中抗生素药物的处理能力十分有限，大多采用吸附净化[2]、化学处理[3]与UV辐照[4]等方法，但上述方法受到水体容量、经济成本、环境影响等因素的限制难以广泛推广。 
　　根据养殖水体特点，常用的水样前处理技术有固相萃取[5]、液液萃取[6]、分散液液微萃取[7]等。相较于其他方法，固相萃取具有简单、快捷、富集与净化能力强等特点，已较好应用于水样中抗生素[8]与农药[9]的测定。该研究将固相萃取技术和液相色谱法串联起来，建立了养殖水体中磺胺类的测定方法，用以解决磺胺类部分组分回收率低以及液相色谱仪样品分析时间过长等问题。 
　　1 材料与方法 
　　1.1 试验材料 
　　1.1.1 主要仪器和试剂 仪器耗材：ACQuity型液相色谱仪 （PDA检测器，美国Waters公司），20-SPE型固相萃取装置（美国Agilent公司），ODS-C18柱，PEP柱，PLEXA PCX柱，PRS柱。药品试剂：乙腈（色谱纯），乙酸乙酯（色谱纯），二氯甲烷（色谱纯），环己烷（色谱纯），甲醇（色谱纯），氯化钠（分析纯），2%乙酸缓冲液。1.1.2 标准物质 磺胺嘧啶（SD）、磺胺噻唑（ST）、磺胺甲基嘧啶（SM1）、磺胺二甲基嘧啶（SM2）、磺胺甲基异噁唑（SMZ）、磺胺多辛（SDM）、磺胺异噁唑（SIZ）、磺胺喹噁啉（SQ）均购于国家标准物质研究中心，纯度均大于98.0%。 
　　1.2 试验方法 
　　1.2.1 样品采集、预处理 分别采集多个代表性的池塘养殖用水，用5 L清洁的玻璃瓶混匀后低温保存。试验前将水样用溶剂过滤器过滤。 
　　1.2.2 固相萃取条件优化 （1）pH值。由于磺胺类药物在不同酸碱度条件下其结构存在较大差异，在经过多种组合比较后，分别将水样pH值调节为4.5、6.0、7.0、8.0、10.0，比较不同pH值条件下水样中磺胺类药物的提取率。（2）提取液。根据养殖水体中磺胺类抗生素的特性，分别选取提取液Ⅰ（乙腈+乙酸乙酯=20+40 mL）和提取液Ⅱ（乙腈+二氯甲烷=20+40 mL）作为提取溶剂，比较两种提取液的萃取效果。（3）氯化钠用量。取3份100 mL水样，分别添加0、5、10 g氯化钠，加入一定量混合标准溶液，比较不同氯化钠添加量对水样中磺胺类药物添加回收率的影响。（4）萃取柱。分别采用PEP柱、Plexa柱、ODS-C18柱、PRS柱4款净化柱进行萃取试验，比较不同萃取柱对水样中磺胺类药物的回收效果。 
　　1.2.3 样品处理 量取100 mL待测水样，调节pH值，转移至250 mL分液漏斗中，添加提取液和氯化钠，混摇2 min，静置分层；用鸡心瓶收集下层有机混合相；再加入提取液重复提取1次，合并两次的萃取液，于40℃旋转蒸发至近干，用5 mL甲醇溶液（5%）溶解瓶内残留物。以5 mL的甲醇活化萃取柱，将样液转移至柱中，用3 mL甲醇溶液复溶瓶内残留物，液体一并转移至柱中；整个固相萃取过程流速控制在1 mL/min，待柱内近干时用15 mL甲醇洗脱串联柱；洗脱液于40℃旋转蒸发至干，用流动相溶解过滤，待液相色谱检测。 
　　1.2.4 色谱检测条件 色谱柱：BEH–C18柱（150 mm×4.6 mm，2.1 ?m）；检测波长：270 nm；色谱柱温：35℃；进样体积：10 ?L。流动相梯度洗脱条件见表1。 
　　1.2.5 方法鉴定 以优固相萃取条件对8种磺胺类药物的混合标准溶液进行测定分析，考察方法的检出限和精密度。 
　　1.2.6 方法应用 采集了长沙地区网箱养殖基地、池塘养殖基地、无公害养殖池塘3种不同类型养殖水域的4个水样，按该研究建立的方法进行检测分析。 
　　2 结果与讨论 
　　2.1 pH值的确定 
　　由表2可知，磺胺二甲基嘧啶在pH值为4.5时提取率高，磺胺喹噁啉在pH值为6.0和10.0时均有较高的提取率，其余6种磺胺物质提取的适pH值均为6.0。因此，综合考虑以6.0作为试验水样的提取pH值，水样中各磺胺类药物的提取率均在60%以上。 
　　2.2 提取液的选择 
　　对比两种提取液发现，提取液Ⅰ中乙酸乙酯会出现在液体的上层影响提取液的收集，同时由于乙酸乙酯只能从乙腈与水样的混合液中反萃取少量的乙腈也影响提取效率；而采用提取液Ⅱ进行提取时，二氯甲烷能从乙腈水溶液中反萃取乙腈后出现在液体的下层，方便萃取液的收集和再次萃取，样品分析图谱中无溶剂峰和基质干扰峰影响，提取效率较高。故而选用乙腈+二氯甲烷作为前处理的佳提取液。使用时，先添加20 mL乙腈，与水样混匀，再加入20 mL二氯甲烷，萃取1次之后，再加入20 mL二氯甲烷重复提取1次；合并两次萃取液，进行下一步操作。 
　　2.3 氯化钠用量选择 
　　Cu2+、Fe3+、Zn2+、Mg2+等金属离子存在时会影响目标化合物的回收率，而适量的Cl-能结合部分金属离子，有利于提高样品的回收率。结果显示，不添加氯化钠时，二氯甲烷层会出现浑浊，样品的回收率为20.3%～40.2%；添加5 g氯化钠时，二氯甲烷与乙腈混合液和水相分层清晰，有机相透亮，样品的回收率为70.6%～90.4%；添加10 g氯化钠时，高浓度的盐溶液与有机相分界面上出现少量的氯化钠颗粒物，且上层的水相与分液漏斗接触面会形成的气泡影响分层效果及回收率，试验回收率仅在65%上下。因此，添加5 g氯化钠为适宜。 
　　2.4 固相萃取柱的选择 
　　磺胺类化合物大多为弱极性， PEP柱、Plexa柱、ODS-C18柱、PRS柱4款净化柱均有一定富集能力。从表3中可以看出，磺胺噻唑和磺胺喹噁啉采用PEP柱净化时回收效率高，其他6种磺胺类药物的净化效果均以ODS-C18柱的，回收率在61%以上。因此，选用PEP与ODS-C18串联柱形式进行样品净化效果，如图1所示，减少了样品基质的干扰，提高了方法的灵敏度，回收。 
　　2.5 标准曲线的制作、检出限、精密度及回收率 
　　从表4中可以看出，8种磺胺类药物的检出限为0.01～0.03 mg/L。方法的精密度、回收率试验结果如表5所示，采用试验优化的方法进行测定，8种磺胺类药物的平均回收率为73%，平均相对标准偏差（RSD）为4.24%，能满足实验室对养殖水体磺胺类残留物检测技术的要求。 
　　2.6 水和土壤环境样品的测定 
　　由表6可知，不同区域养殖水域内磺胺类抗生素的总含量在0.25～20.26 mg/L之间，由高到低排序依次为池塘养殖基地>无公害养殖池塘>网箱养殖基地2>网箱养殖基地1。这样的结果与养殖水域的面积、饵料用量、养殖密度、水体交换与自净能力等因素有关。普通池塘养殖基地因施用含抗生素的饵料和药物，使水样中抗生素含量较高；无公害养殖池塘能规范饵料与药物的用量，较好地控制了水体中抗生素的含量。网箱养殖基地不以单一的投喂方式作为饵料来源，自然供给也能为养殖生物提供食物补充；同时，由于单位面积内水体的交换频率高、物种密度低、治疗类抗生素用量少，所以水体中抗生素含量较低；其中，网箱养殖基地1较网箱养殖基地2水域面积更大、自然水源补给更充裕，故其水体中抗生素含量更低。3 结 论 
　　研究建立了养殖水体中8种磺胺类抗生素残留物的液相色谱检测方法。实践表明，该方法简便可行、快速、回收率较高，能满足实验室对养殖水体磺胺类残留物新检测技术的要求。 
　　采用固相萃取-液相色谱法测定养殖水体中8种磺胺类残留量，以乙腈-二氯甲烷为提取剂，提取后残留杂质较少，提取效率高；以PEP柱与ODS-C18柱进行富集净化，有效地提高了磺胺类药物检测方法的灵敏度，除磺胺甲基异噁唑与磺胺多辛未*分离外，其余组分均较好地分离，样品图谱峰形对称，组分重现性好；调节pH值至6.0，引入氯化钠增强液液萃取效率，极大地促进了样品的处理效果。该方法中8种磺胺类抗生素的添加回收率为60.0%～89.0%，检出限为0.01～0.03 mg/L，适用于养殖水体中磺胺类药物多组分残留的分析测定。